既往糖尿病对颅脑损伤严重程度的影响

既往糖尿病对颅脑损伤严重程度的影响

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研究背景

根据国际糖尿病联合会（IDF）的一份公告，全球糖尿病患病率持续上升，年糖尿病发病率为4.63亿例，其中65岁以上人群占19.3%。以IDF预测，如果不采取有效措施，到年，这一数字将增至7亿。与健康人相比，糖尿病老年人绊倒易跌倒的风险增加一倍，血管和神经组织的大量分子改变导致伤口愈合延迟，损害细胞和免疫功能，影响伤口愈合过程。

据报道，糖尿病患者TBI的死亡率约为非糖尿病患者的1.5倍。2型糖尿病（DM2）患者常伴有合并症，这些合并症可加重脑损伤的风险。一些研究利用糖尿病动物模型，包括脑缺血和血糖控制等联合模型，探讨了糖尿病与脑损伤的关系。最近的研究表明，吸入高浓度氢气可显著改善DM和TBI大鼠的预后和生存率，这种益处是通过抗氧化和抗凋亡途径实现的。这项研究与我们的不同之处在于，它侧重于TBI对高脂饲料喂养大鼠诱导的DM的治疗作用，而没有显示糖尿病加重TBI，因为没有使用野生型大鼠。糖尿病影响TBI预后的潜在机制和程度尚不清楚。

脑外伤后的组织损伤引起脑内驻留细胞功能的改变和外周细胞的募集。星形胶质细胞是胶质细胞，在损伤部位增殖，分泌炎症介质，损伤神经元，募集外周细胞，激活小胶质细胞。小胶质细胞是造血来源的胶质细胞，执行吞噬和分泌炎症介质。中性粒细胞很快到达损伤部位。它们也是吞噬细胞并释放有毒介质，如活性氧。单核细胞分化为巨噬细胞和树突状细胞，这些细胞聚集到大脑中。巨噬细胞进行吞噬和分泌炎症介质；树突状细胞和T细胞也可作为炎症细胞，但它们在TBI病理中的确切作用仍不清楚。此外，损伤部位的神经元被拉伸、弯曲或切断。我们预期糖尿病患者的这些过程会受到干扰。

我们假设先前存在的糖尿病由于微循环障碍和长期炎症而加重TBI。在本研究中，我们观察了TBI引起的DM和非DM小鼠神经功能的改变、炎性细胞向损伤部位的迁移以及脑挫伤的程度，旨在探讨DM引起TBI加重的机制。

研究方法

在本研究中，我们研究了TBI引起的KK-Ay（DM）和C57BL/6J（非DM）小鼠神经功能的改变、炎性细胞向损伤部位的迁移以及脑挫伤的程度。在每只小鼠中使用控制性皮质撞击装置诱导TBI。磁共振成像测量脑挫伤体积。神经功能的变化采用以下动物行为任务进行评估：神经严重程度评分（NSS）、Morris水迷宫、强迫游泳试验和游梁。对脑切片进行免疫组织化学检查，以评估中性粒细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和巨噬细胞的浸润，并检测细胞凋亡。这些实验在伤后1-90天进行（每组超过5个实验/时间点）。

研究结果

与非DM小鼠相比，DM小鼠的脑挫伤体积明显增大，NSS明显恶化，脑组织标本中的中性粒细胞、巨噬细胞和凋亡细胞数量增多。

图1：体重的变化。结果以平均数表示±体重扫描电镜（g）。DT组=实心正方形（n=17），DS组=实心圆（n=9），DN组=实心三角形（n=10），NT组=开放正方形（n=17），NS组=开放圆（n=6），NN组=开放三角形（n=9）。

所有组在同一天的体重比较p0.05的Bonferroni事后检验显示为a（DTvs.NT）、b（DTvs.DS）、c（DTvs.DN）、d（NTvs.NS）和e（NTvs.NN）。星号表示使用Bonferroniposthoc测试获得的同一组患者术前和术后体重之间存在显著差异（p0.05）。

糖尿病；DT、DM小鼠；DN，DM小鼠na?价值工程；假手术治疗DS、DM小鼠；NN，na非DM小鼠?价值工程；NS，假手术非DM小鼠；NT，TBI非DM小鼠；PID，伤后一天；创伤性脑损伤；VS.对。

图2：创伤性脑损伤体积和神经系统严重程度评分（NSS）的评估。

（A）在PIDs7和上获取bregma0.5-2.5mm之间DT和NT的T2加权磁共振图像。每幅图像上TBI的高信号区域都被圈出（绿色），并用来测量损伤体积。

（B）得到了DT（填充正方形；n=5）和NT（开方；n=5）在PIDs1–上。星号表示Bonferroni的DT与NT的事后检验与p0.05相关。数据以平均数表示±扫描电镜。

（C）在PIDs1–28上评估糖尿病和非糖尿病小鼠TBI后的神经严重性评分（NSS）。

DT组=填充正方形（n=7）和NT组=开放正方形（n=8）。Sham和na?所有任务得分为0分的ve组被忽略。p0.05的Bonferroni事后检验在同一天显示为a（DTvs.NT）、b（DTvs.DS）、c（DTvs.DN）、d（NTvs.NS）和e（NTvs.NN）。数据以平均数表示±扫描电镜。

糖尿病；DT、DM小鼠；神经系统严重程度评分；NT，TBI非DM小鼠；PID，伤后一天；创伤性脑损伤；VS.对。

图3：在PIDs1-5、7-12、28-32和86-90上评估TBI后Morris水迷宫的表现。

DT组=实心正方形（n=10），DS组=实心圆（n=6），DN组=实心三角形（n=10），NT组=开放正方形（n=9），NS组=开放圆（n=6），NN组=开放三角形（n=9）。p0.05的Bonferroni事后检验在同一天显示为a（DTvs.NT）、b（DTvs.DS）、c（DTvs.DN）、d（NTvs.NS）和e（NTvs.NN）。数据以平均数表示±扫描电镜。创伤性脑损伤；糖尿病；DT、DM小鼠；DN，DM小鼠na?价值工程；假手术治疗DS、DM小鼠；NT，TBI非DM小鼠；NN，na非DM小鼠?价值工程；NS，假手术非DM小鼠；PID，伤后一天；VS.对。

图4：对糖尿病和非糖尿病小鼠TBI后pids1、7、28和86强迫游泳试验性能的评价。

p0.05的Bonferroni事后检验在同一天显示为a（DTvs.NT）、b（DTvs.DS）、c（DTvs.DN）、d（NTvs.NS）和e（NTvs.NN）。数据以平均数表示±扫描电镜。n（DT）=10，n（DS）=6，n（DN）=10，n（NT）=9，n（NS）=6，n（NN）=9。

糖尿病；DN，DM小鼠na?价值工程；假手术治疗DS、DM小鼠；DT、DM小鼠；NN，na非DM小鼠?价值工程；NS，假手术非DM小鼠；NT，TBI非DM小鼠；PID，伤后一天；创伤性脑损伤；VS.对。

图5：在PIDs1–28上对TBI后的游梁试验性能进行评估。

结果显示为穿过每个梁所需的时间，如大正方形（28cm:a）、小正方形（12cm:B）、大圆（28cm:C）和小圆（17cm:D）。DT组=实心正方形（n=7），DS组=实心圆（n=6），DN组=实心三角形（n=6），NT组=开放正方形（n=7），NS组=开放圆（n=6），NN组=开放三角形（n=6）。p0.05的Bonferroni事后检验在同一天显示为a（DTvs.NT）、b（DTvs.DS）、c（DTvs.DN）、d（NTvs.NS）和e（NTvs.NN）。数据以平均数表示±扫描电镜。创伤性脑损伤；糖尿病；DT、DM小鼠；DN，DM小鼠na?价值工程；假手术治疗DS、DM小鼠；NT，TBI非DM小鼠；NN，na非DM小鼠?价值工程；NS，假手术非DM小鼠；PID，伤后一天。

图6。PIDs1–90上大脑中的中性粒细胞。

（A）在PIDs1–90处，可以在挫伤周围组织中观察到中性粒细胞。比例=μm(B）条形图显示每0.1mm2的中性粒细胞数。用星号表示同一天的DT与DS、NT与NS、DT与NT的显著差异（p0.05）。

数据以平均数表示±标准偏差。对于PID1、3、7、14、30和60，n（DT）=6；对于PID90，n（DT）=8；对于PID1、3、7、14、30、60和90，n（DS）=6；对于PID1和90，n（NT）=7；对于PID3、14、30和60，n（NT）=6；对于PID7，n（NT）=9；对于PID1、3、7、14、30、60和90，n（NS）=6。

糖尿病；假手术治疗DS、DM小鼠；DT、DM小鼠；NS，假手术非DM小鼠；NT，TBI非DM小鼠；PID，伤后一天；创伤性脑损伤。

图7。PIDs1–90上大脑中的GFAP阳性细胞。

（A）在PIDs1～90处，挫伤周围组织可见GFAP阳性星形胶质细胞。比例=μm(B）条形图显示每0.1mm2的阳性GFAP细胞数。用星号表示同一天的DT与DS、NT与NS、DT与NT的显著差异（p0.05）。数据以平均数表示±标准偏差。对于PID1、3、7、14、30和60，n（DT）=6；对于PID90，n（DT）=8；对于PID1、3、7、14、30、60和90，n（DS）=6；对于PID1和90，n（NT）=7；对于PID3、14、30和60，n（NT）=6；对于PID7，n（NS）=9；对于PID1、3、7、14、30、60和90，n（NS）=6。

糖尿病；假手术治疗DS、DM小鼠；DT、DM小鼠；NS，假手术非DM小鼠；NT，TBI非DM小鼠；PID，伤后一天；创伤性脑损伤。

图8：PIDs1–90上大脑中的F4/80阳性细胞。

（A）在PIDs1-90处，F4/80阳性巨噬细胞出现在挫伤周围组织区。比例=μm(B）条形图显示了每0.1mm2中F4/80正极电池的数量。用星号表示同一天的DT与DS、NT与NS、DT与NT的显著差异（p0.05）。数据以平均数表示±标准偏差。对于PID1、3、7、14、30和60，n（DT）=6；对于PID90，n（DT）=8；对于PID1、3、7、14、30、60和90，n（DS）=6；对于PID1和90，n（NT）=7；对于PID3、14、30和60，n（NT）=6；对于PID7，n（NS）=9；对于PID1、3、7、14、30、60和90，n（NS）=6。

糖尿病；DN、DS、DM小鼠假手术；DT、DM小鼠；NS，假手术非DM小鼠；NT，TBI非DM小鼠；PID，伤后一天；创伤性脑损伤。

图9：PIDs1–90上大脑中的Iba1阳性细胞。

（A）PIDs1～90处挫伤周围组织可见iba1阳性的小胶质细胞。比例=μm(B）条形图显示了每0.1mm2中Iba1阳性细胞的数量。用星号表示同一天的DT与DS、NT与NS、DT与NT的显著差异（p0.05）。数据以平均数表示±标准偏差。对于PID1、3、7、14、30和60，n（DT）=6；对于PID90，n（DT）=8；对于PID1、3、7、14、30、60和90，n（DS）=6；对于PID1和90，n（NT）=7；对于PID3、14、30和60，n（NT）=6；对于PID7，n（NS）=9；对于PID1、3、7、14、30、60和90，n（NS）=6。

糖尿病；假手术治疗DS、DM小鼠；DT、DM小鼠；NS，假手术非DM小鼠；NT，TBI非DM小鼠；PID，伤后一天；创伤性脑损伤。

图10：PIDs1–90上大脑中切割的半胱天冬酶-3（CCasp3）阳性细胞。

（A）在PIDs1–90处，在挫伤周围组织中可以观察到CCasp3阳性细胞。比例=μm(B）条形图显示每0.1mm2的CCasp3阳性细胞数。用星号表示同一天的DT与DS、NT与NS、DT与NT的显著差异（p0.05）。数据以平均数表示±标准偏差。对于PID1、3、7、14、30和60，n（DT）=6；对于PID90，n（DT）=8；对于PID1、3、7、14、30、60和90，n（DS）=6；对于PID1和90，n（NT）=7；对于PID3、14、30和60，n（NT）=6；对于PID7，n（NS）=9；对于PID1、3、7、14、30、60和90，n（NS）=6。

糖尿病；假手术治疗DS、DM小鼠；DT、DM小鼠；NS，假手术非DM小鼠；NT，TBI非DM小鼠；PID，伤后一天；创伤性脑损伤。

结论

这项研究表明，正常小鼠和糖尿病小鼠的预后是不同的，即使它们遭受了同样严重程度的TBI。因此，对TBI患者进行DM和其他既往疾病评估，对提供适当的治疗或确定正确的死亡原因是非常重要的。

讨论

众所周知，炎症细胞浸润脑损伤区域；首先是中性粒细胞，其次是从单核细胞分化而来的单核细胞和巨噬细胞。此外，巨噬细胞和中性粒细胞相互激活：巨噬细胞直接被中性粒细胞产物激活；中性粒细胞被巨噬细胞分泌的细胞因子激活。我们的数据显示，随后是巨噬细胞，损伤后不久中性粒细胞增加，这与先前的知识一致。刺激诱导的凋亡细胞被中性粒细胞和巨噬细胞吞噬。吞噬能力不足被认为是许多慢性和自身免疫性疾病延迟愈合或恶化的原因，因为坏死的继发性发生会引起炎症反应。此外，巨噬细胞摄取凋亡的中性粒细胞可导致炎症消退，但如果摄取系统有缺陷，则会导致伤口愈合延迟。糖尿病患者伤口愈合受损的原因是缺乏巨噬细胞的能力。在本研究中，DT组中性粒细胞数量的增加表明早期急性炎症程度的差异。与NT组相比，DT组巨噬细胞数量从PID3增加到PID60，可以解释为DM所致的严重慢性炎症。在PID90时，DT组的巨噬细胞数量几乎与NT组相同，表明DM引起的炎症加重在PID90时减轻到与非DM小鼠相同的水平。对缺血性脑损伤大鼠的研究表明，DM可增加皮层细胞凋亡活性，促进神经元的破坏。在我们的实验中，DT组的凋亡细胞数在PID7到90之间高于NT组，并且认为DM是由于TBI增加了细胞凋亡而导致神经损伤的。根据这些结果，我们认为DM在损伤后立即引起中性粒细胞浸润，从而加重炎症反应。此后，炎症反应加重和伤口愈合延迟已经发生了几个月，因为浸润的巨噬细胞和凋亡细胞增加，直到PID60或90。另外，在PID90上，炎症峰值已经过去，并且正在消退，但尚未完全消除。此外，TBI组GFAP和Iba1的表达水平与其他各组不同。然而，糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠之间没有差异。在用STZ诱导的胰腺破坏诱导大鼠1型DM（DM1）的实验中，证实与正常大鼠相比，星形胶质细胞和小胶质细胞被激活，数量增加。本研究所用的DM2小鼠KKAy对DM所致的胶质细胞几乎没有影响，对TBI几乎没有影响。因此，DM1和DM2对炎症细胞的影响可能不同。

在这个实验中，DT组和NT组之间观察到的差异的原因需要解释。血脑屏障（BBB）由内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞组成，是通过调节中枢神经系统血液和组织站之间的物质交换来保护大脑的机制。BBB与周围的神经细胞和小胶质细胞相互作用并维持其功能，这些细胞统称为神经血管单位。糖尿病由于VEGF和Ang2表达增加，PDGFR增加，导致微血管不稳定和周细胞脱落β失活和过度转化生长因子β促进基底膜分子沉积的信号。周细胞松弛促进多核中性粒细胞外渗。因此，在这项研究中，可以推断TBI应用于糖尿病引起的脑周细胞松弛引起的BBB破坏，导致中性粒细胞过度迁移和随后的巨噬细胞吸引。提示这些情况是DT组中性粒细胞和巨噬细胞较NT组明显增多的原因之一。

这项研究表明，正常小鼠和糖尿病小鼠的预后是不同的，即使他们获得了同样严重的TBI。这一点也应该在人类身上得到证实，关于糖尿病患者接受TBI后病情恶化的更多细节和机制需要进一步研究。对TBI患者进行糖尿病及其他疾病的评估，对治疗TBI，确定正确的死亡原因具有重要意义。